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Amplite NAD+/NADH检测试剂盒（荧光法） 红色荧光
| 货号 | 15257 | 存储条件 | f/l |
| 规格 | 400 Tests | ||
| Ex (nm) | 571 | Em (nm) | 585 |
| 分子量 | 溶剂 | ||
| 产品详细介绍 | |||
简要概述
Amplite NAD+/NADH检测试剂盒（荧光法） 红色荧光是AAT Bioquest研发的检测NAD+/NADH的试剂盒。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD +）和NADP +是细胞中发现的两种重要的辅因子。NADH是NAD +的还原形式，NAD +是NADH的氧化形式。NAD形成NADP，通过酯键将基团添加到腺苷核苷酸的2'位置。NADP用于合成代谢生物反应，例如脂肪酸和核酸合成，其需要NADPH作为还原剂。 在叶绿体中，NADP是在光合作用的初步反应中重要的氧化剂。通过光合作用产生的NADPH用作卡尔文光合作用循环中生物合成反应的还原能力。
传统的NAD / NADH和NADP / NADPH测定通过监测340nm处NADH或NADPH吸收的变化来进行。 Amplite™荧光总NAD和NADH检测试剂盒为敏感检测NAD和NADH提供了一种便捷的方法。系统中的酶特异性识别酶循环反应中的NAD / NADH，其显着提高了检测灵敏度。此外，该测定具有非常低的背景，因为其在红色可见范围内运行，这显着降低了生物样品引起的干扰。该测定已证明在Ex / Em = 540 / 590nm处具有高灵敏度和低干扰。百萤生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的Amplite NAD+/NADH检测试剂盒。
Amplite™荧光总NAD和NADH分析试剂盒提供灵敏的一步法分析，可在100μL分析体积（100nM;图1）中检测少至10皮摩尔的NAD（H）。 该测定可以以方便的96孔或384孔微量滴定板形式进行，并且容易适应自动化而无需分离步骤。 其信号可通过荧光酶标仪在Ex / Em = 530-570nm / 590-600nm（Ex / Em = 540 / 590nm）或吸光度酶标仪在~576nm处容易地读取。
产品说明书
96孔板测定示例
概述
准备NAD / NADH反应混合物（50μL）
添加NADH标准品或测试样品（50μL）
在室温下孵育15分钟--2小时
监测Ex / Em = 540 / 590nm处的荧光强度
操作方法
1.准备NADH储备溶液：
将200μLPBS缓冲液加入到NADH标准品（组分C）的小瓶中，得到1mM（1nmol / L）NADH储备溶液。
注意：未使用的NADH储备溶液应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。
2.准备NAD / NADH反应混合物：
将10mL NAD / NADH传感器缓冲液（组分B）加入NAD / NADH再循环酶混合物（组分A）的瓶中，并充分混合。
注意：NAD / NADH反应混合物足以用于两个96孔板。 未使用的NAD / NADH反应混合物应分成一次性等分试样并储存在-20℃。
3.准备NADH标准品的系列稀释液（0至10μM）：
3.1将10μL的NADH储备溶液（来自步骤1）加入到990L PBS缓冲液（pH 7.4）中，以产生10μM（10pmol / L）NADH标准溶液。
注意：稀释的NADH标准溶液不稳定，应在4小时内使用。
3.2取200μL10μMNADH标准溶液进行1：3连续稀释，得到NADH标准品的3,1,0.3,0.1,0.03,0.01和0μM连续稀释液。
3.3如表1和2中所述，将含有NADH标准品和含NAD / NADH的测试样品的系列稀释液加入到固体黑色96孔微量培养板中。
注意：根据需要准备细胞或组织样本。
表1实心黑色96孔微孔板中NADH标准品和测试样品的布局
BL | BL | TS | TS |
NS1 | NS1 | …. | …. |
NS2 | NS2 | ||
NS3 | NS3 | ||
NS4 | NS4 | ||
NS5 | NS5 | ||
NS6 | NS6 | ||
NS7 | NS7 |
注意：NS = NADH标准，BL =空白对照，TS =测试样品。
表2.每个孔的试剂组成
NADH Standard | Blank Control | Test Sample |
Serial Dilutions*: 50 μL | PBS: 50 μL | 50 μL |
注意：将连续稀释的NADH标准品（0.01μM至10μM）加入NS1至NS7的孔中，一式两份。 高浓度的NADH（例如，>100μM，浓度）可能由于NADH传感器（对非荧光产物）的过度氧化而导致荧光信号降低。
4.在上清液反应中运行NAD / NADH测定：
4.1将50μL的NADH反应混合物（来自步骤2）加入NADH标准品，空白对照和测试样品（来自步骤3.3）的每个孔中，使得总NADH测定体积为100μL/孔。
注意：对于384孔板，每孔加入25μL样品和25μLNADH反应混合物。
4.2在室温下孵育反应15分钟至2小时，避光。
4.3用Ex / Em = 540 / 590nm的荧光板读数器监测荧光增加。
注1：也可将板的内容物转移到白色透明底板上，用吸光度酶标仪在576±5nm波长下读数。 与荧光读数相比，吸收检测具有较低的灵敏度。
注意2：对于NAD / NADH比率测量，建议使用试剂盒15263。
注意3：对于基于细胞的NAD / NADH测量，建议使用ReadiUse™哺乳动物细胞裂解缓冲液* 5X *（目录号20012）裂解细胞。
数据分析
空白孔中的荧光（仅用PBS缓冲液）用作对照，并从具有NADH反应的那些孔的值中减去。 NADH标准曲线如图1所示。
注意：荧光背景随时间增加，因此减去每个数据点的空白孔的荧光强度值是很重要的。
图1.使用NOVOStar酶标仪（BMG Labtech），在固体黑色96孔板中用Amplite TM总NAD和NADH测定试剂盒测量NADH剂量反应。 在孵育1小时（n = 3）时可以检测到低至100nM（10pmol /孔）的NADH，而NADPH没有响应。
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