Cell Meter 线粒体羟基自由基检测试剂盒

简要概述

        Cell Meter 线粒体羟基自由基检测试剂盒是美国AAT Bioquest生产的用于线粒体检测的试剂盒，细胞内羟基自由基的检测对于理解适当的细胞氧化还原调节及其失调对各种病理的影响至关重要。羟基（HO·）是与其他分子高度反应的活性氧（ROS）之一，以实现稳定性。通常，羟基被认为是氧化代谢的有害副产物，其可以在生命系统中引起分子损伤。它显示平均寿命为10-9秒，可以与几乎所有生物分子如核DNA，线粒体DNA，蛋白质和膜脂质发生反应。 AAT Bioquest的Cell Meter 线粒体羟基自由基检测试剂盒经过优化，可用于检测线粒体中的ROS。 MitoROS OH580是活细胞渗透探针，可以快速和选择性地靶向活细胞中的羟基自由基。当它与OH·反应时产生红色荧光，并且可以在Ex / Em = 540 / 590nm处容易地读取。 Cell Meter 线粒体羟基自由基检测试剂盒提供灵敏的荧光探针，可在孵育1小时后检测活细胞中的OH·。该试剂盒可用于荧光酶标仪和荧光显微镜应用。百萤生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的Cell Meter 线粒体羟基自由基检测试剂盒。 

产品说明书

96孔板分析示例

概述

准备细胞用MitoROS OH580工作溶液

在37ºC孵育细胞60分钟

用测试化合物孵育细胞（诱导OH·）

在Ex / Em = 540/590 nm处监测荧光增加

注意：使用前在室温下解冻所有组件。

操作步骤

1.准备细胞：

1.1对于粘附细胞：在生长培养基中将细胞过夜，10,000至40,000个细胞/孔/90μL用于96孔板或2,500至10,000个细胞/孔/20μL用于384孔板。

1.2对于非粘附细胞：从培养基中离心细胞，将细胞沉淀悬浮于培养基中，100,000-200,000细胞/孔/90μL，96孔poly-D赖氨酸平板或25,000-50,000细胞/孔/ 对于384孔聚-D赖氨酸板，20μL。 在实验之前，在制动器关闭的情况下以800rpm离心板2分钟。

注意：应对每个细胞系进行单独评估，以确定细胞密度。

2.准备MitoROS OH580方案：

2.1Prepare MitoROS OH580储备液（500X）：将50μLDMSO（组分C）加入MitoROS OH580（组分A）的小瓶中，并充分混合。

注意：25μL重组的MitoROS OH580原液足以容纳1个平板。 如果管子密封并且避光，可以将未使用的部分等分并在≤-20℃下储存超过一个月。避免反复冻融循环。

2.2准备MitoROS OH580工作溶液：将25μL500XDMSO重构的MitoROS OH580储备溶液（来自步骤2.1）加入10 mL分析缓冲液（组分B）中，并充分混合。 该工作溶液在室温下稳定至少2小时。

3.运行羟基自由基测定：

3.1取出培养基，加入100μL/孔（96孔板）或25μL/孔（384孔板）的MitoROS OH580工作溶液（步骤2.2）到细胞板中。将细胞在37ºC孵育1小时。

3.2为了诱导羟基自由基，用37℃的所需缓冲液（如PBS或HHBS）中的文本化合物处理细胞一段所需的时间，避光。

注意1：我们用芬顿反应（10μMCuCl2和100μMH2O2）在37℃处理HeLa细胞1小时，以诱导外源性羟基自由基。详细信息请参见图1。

注意2：我们用生长培养基中的PMA（佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯）在37℃下处理RAW 264.7细胞4小时，以刺激内源性羟基自由基。详细信息请参见图2。

3.3用HHBS或DPBS将细胞洗涤2-3次，并向每个孔中加入100μL测定缓冲液（组分B）。

3.4使用具有TRITC滤光片组的荧光显微镜观察细胞中的荧光信号，或使用荧光酶标仪在Ex / Em = 540 / 590nm（截止= 570nm）下以底部读取模式测量荧光增加。

数据分析

图1.使用MitoROS OH580（Cat＃16055）在HeLa细胞中测量羟基自由基的荧光图像。 将HeLa细胞与MitoROS OH580工作溶液在37℃下孵育1小时，然后用HHBS洗涤一次。 芬顿反应：然后将细胞用10μMCuCl2和100μMH2O2在1X HBSS缓冲液中于37℃处理1小时。 对照：将HeLa细胞保持在1X HBSS缓冲液中而不进行处理。 用HHBS洗涤3次后，使用具有TRITC过滤器组（红色）的荧光显微镜测量HeLa细胞。 细胞核用Hoechst 33342（Cat＃17530，Blue）染色。

图2.使用MitoROS OH580（Cat＃16055）检测RAW 264.7细胞中的细胞内羟基自由基。 将细胞与MitoROS OH580工作溶液在37℃下孵育1小时，然后用HHBS洗涤一次。 然后将细胞在没有或与PMA（佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯，10-500ng / mL）在生长培养基中于37℃温育4小时。 用HHBS洗涤3次后，使用具有TRITC过滤器组的荧光显微镜测量HeLa细胞。